实验十一 维生素B₁₂的吸收曲线绘制

及注射液的含量测定

 

一、实训目标

1、掌握752型分光光度计的使用方法。

2、掌握注射剂含量的测定和计算方法。

3、熟悉测绘吸收曲线的一般方法。

二、实训原理

维维生素B₁₂是含Co的有机化合物，其注射液为粉红色至红色的澄明液体。要测定B₁₂注射液的含量，可以用紫外－可见分光光度法测定，用此法进行含量测定，必须知道B₁₂的λ_max，λ_max可以通过绘制吸收曲线来得到。

吸收曲线：将不同波长的单色光依次通过被分析的物质，分别测得不同波长下的吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标所描绘的曲线。吸光度最大时对应的波长为λ_max，在λ_max处测吸光度。B₁₂在278，361，550nm处有最大吸收，在λ_max处测得A，根据吸光系数法可以求出注射液中B₁₂的含量。

吸光系数法：A=Ecl

实验中要求测361nm处的A，相应的吸光系数为207。

三、实训资源

仪器：752型紫外－可见分光光度计，10ml容量瓶，5ml吸量管

试剂：0.1g·L^-1维生素B₁₂水溶液，维生素B₁₂注射液(市售品)。

四、实训内容及实训操作步骤

1、752型分光光度计的使用

（1）开启电源开关，使仪器预热30分钟。

（2）用波长选择旋钮设置所需的分析波长。

（3）将装参比溶液的比色皿置于光路，打开样品室盖，调节T旋钮，使显示器指针指在“0.00％”。

（4）将装参比溶液的比色皿置于光路，关闭样品室盖，调节A旋钮，使显示器指针指在“100.00％”。

（5) 重复操作(3)和(4)，直至仪器显示稳定。

（6）将装参比溶液的比色皿置于光路，关闭样品室盖，进行测定，在显示器上读出A。

（7）仪器使用完毕，关闭电源，拔下电源插头。取出比色皿，洗净、晾干。复原仪器，盖上防尘罩。

2、吸收曲线的绘制

将0.1g·L^-1维生素B₁₂溶液置于1cm比色皿中，以蒸馏水为空白溶液，在不同波长(340nm~580nm之间，其中从350nm~370nm和540~560nm每间隔5nm测量一次，其余每间隔20nm测量一次吸光度)下测量相应的吸光度。然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘出吸收曲线。从吸收曲线上得到最大吸收波长，从而选择测定维生素B₁₂的适宜波长。

3、注射液含量测定

避光操作。准确吸取0.50ml维生素B₁₂注射液于10ml容量瓶中，加水定容至刻度线。然后将溶液置于1cm比色皿中，在361nm波长条件下以蒸馏水作为空白测定吸光度，按C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P的吸收系数为207计算维生素B₁₂标示量的百分含量。

计算公式：

五、注意事项

1、在每次测定前，首先应做吸收池配套性试验。即将同样厚度的4个比色皿都装相同溶液，在所选波长处测定各比色皿的透光率，其最大误差∆T应不大于0.5%。

2、仪器在不测定时，应随时打开暗箱盖，以保护光电管。

3、为使比色皿中测定溶液与原溶液的浓度一致，需用原溶液荡洗比色皿2~3次。

4、比色皿内所盛溶液以超过皿高的2/3为宜。过满溶液可能溢出，使仪器受损。使用后应立即取出比色皿，并用自来水及蒸馏水洗净，倒立晾干。

5．比色皿一般用水荡洗，如被有机物污染，宜用HCl－乙醇(1+2)浸泡片刻，再用水冲洗，不能用碱液或强氧化性洗液清洗。切忌用毛刷刷洗，以免损伤比色皿。

6．λ＜350nm时使用氢灯，λ＞350nm时使用钨灯。

七、反馈评价

1、试比较用标准曲线法与吸光系数法定量的优缺点？

2、单色光不纯对于测得的吸收曲线有什么影响？