第九章  紫外－可见分光光度法 

第一节  光谱分析概述

掌握　紫外-可见分光光度法的基本原理

      定性定量分析方法 

熟悉　光谱分析概述

      紫外-可见分光光度光度计 

了解　紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构

      分析中的应用简介

一、电磁辐射与电磁波谱

（一）电磁辐射

1、光的波粒二象性

波动性：电磁辐射为正弦波（波长、频率、速度、振幅），传播速度c光波的波长λ和频率ν三者的关系：c  =λ ·ν或λ= c  /ν粒子性：光子的能量E与光波的频率或波长的关系是：E = h  · ν = h c /λ当物质发射电磁辐射或者电磁辐射被物质吸收时，就会发生能量跃迁。        

（二）电磁波谱

γ射线 → X 射线 → 紫外光→可见光→ 红外光→ 微波→无线电波

二、光学分析法的分类

  定义：利用光电转换或其它电子器件测定“辐射与物质相互作用”之后的辐射强度等光学特性，进行物质的定性和定量分析的方法。

1、光谱法与非光谱法

光谱法是基于物质与辐射能作用时，分子发生能级跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长强度进行分析的方法。

2、吸收光谱与发射光谱

吸收光谱又称吸收曲线，是以波长l（nm）为横坐标，吸光度A（或透光率T）为纵坐标所描绘的曲线。

发射光谱法：物质的原子、分子或离子在一定条件下，由低能态（基态）跃迁至高能态（激发态），再由高能态跃迁至低能态，同时产生电磁辐射，根据这种光谱而建立的分析方法称为发射光谱法。

原子光谱与分子光谱

三、紫外-可见吸收光谱法的特点

四、物质对光的选择性吸收

1、物质对光具有选择性吸收

2、不同波长的光具有不同的颜色

3、光的色散        

如果让一束复合光通过棱镜或光栅，就能散射出多种颜色的光，这种现象称为光的色散

4、互补色光

 

第二节  紫外-可见分光光度法的基本原理

 

常用概念

1、吸收光谱

吸收光谱又称吸收曲线，是以波长l（nm）为横坐标，吸光度A（或透光率T）为纵坐标所描绘的曲线。

2、生色团

含有π®π* 和n®π*基团，如C=C、C=O、－N=N－、－NO2、－C=S等。

3、助色团

含有非键电子的饱和基团，如－OH、－NH2、－OR、－SH、－SR、－Cl、－Br、－I等。

4、红移和蓝移

红移是使吸收峰向长波长方向移动的现象。

蓝移是使吸收峰向短波长方向移动的现象

5、增色和减色效应

  使吸收强度增加称增色效应或浓色效应；使吸收强度减弱称减色效应或淡色效应。

一、透光率和吸光度

1、透光率：溶液对光的透射程度T

2、吸光度：溶液对光的吸收程度A

A取值范围：0 ~ ∞，A越大，光被吸收的越多 

二、吸收光谱曲线

以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标所描绘的曲线

三、光的吸收定律

1、朗伯-比尔定律

公式推导：一束平行光通过一含有吸光物质物体：

（S-物体的截面积，l-厚度，n-吸光质点数，光通过此物体后，由于一些光子被吸收，光强从I0降低至I。）

定义：    

          即： A＝ECl （Lambert-Beer定律的数学表达式）

2、讨论

（1）Lambert-Beer定律适合于单色光

（2）由A =-lgT = ECl  得：T = 10-A  = 10-ECl

（3）吸光度的重要性质：吸光度具有加合性。

四、吸光系数

1、摩尔吸光系数ε

是指在一定波长时，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm的吸光度。可以写为A=eCl 

2、比吸光系数α

溶液浓度为1g/L，液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度/

3、E为百分吸光系

物质的特性常数，是指在一定波长时，溶液浓度为1％（W/V），厚度为1cm时的吸光度（比吸光度值），用表示。注意浓度单位。

五、偏离光吸收定律的主要因素

Beer定律，吸光度A与浓度C之间的关系应该是一条通过原点的直线，即E为常数。

1、化学因素

溶液中溶质因浓度改变而有离解、缔合、与溶剂间的作用等原因而发生偏离Beer定律的现象。有时可用控制溶液条件减免。

例：（1）亚甲蓝在稀溶液中为单体，在浓溶液中为二聚体。

   （2）重铬酸钾在水溶液离解成铬酸钾。

2、光学因素

（1）非单色光

     仅用非单色光，由一定的谱带宽度，用S表示，越小光越纯，但仍是复合光。

   设使用l1，l2  两种光，（E₁和E₂），两种光各以强度为与同时入射试样。则因：

                   I = I₀∙10^-ECl

故此混合光的透光率为：

    

当E₁=E₂时，A=E₁CL   A～C 有线性关系

当E₁≠E₂时 A～C 非线性，偏离比尔定律

设l₁是需要的光：当E₁＞E₂时，测得的A值低，负误差；反之，产生正误差。且E₁ 与E₂越接近，误差越小（使用最大吸收波长作为测定波长的优点之一）。

结论：单色光越纯越好；使用最大吸收波长作为测定波长可以减小测定误差。

（2）杂散光

   仪器中常含有与所需波长相差较大的光，一般样品不吸收， 所以不干扰测定。

（3）非平行光

   通过吸收池的非平行光影响l，不同仪器测定A值不同的主要原因。

（4）散射光和反射光

   浑浊溶液产生散射和反射，不能用空白消除影响，共同仅I变小，但I₀不变。A变大，正误差。

 

第三节 紫外－可见分光光度计

紫外-可见分光光度计的种类很多，质量差别悬殊，尽管各种光度计其构造各不相同，但其基本组成部分都是由下图几个部分组成。

一、紫外-可见分光光度计的主要部件

1、光源

光源的功能是提供能量激发被测物质分子，使之产生电子光谱谱带。

可见光区常用的光源是钨灯或碘钨灯，加热到白炽时发出波长约为320～1000nm的连续光谱。光强度与温度成正比，一般工作温度为2600～2870K(熔点3680K)。温度与电源电压有关，电压稳定，光强度稳定。

近紫外光区：使用氢灯或氘灯，产生180～375nm连续光谱。

2、单色器

色散元件的作用是将将复合光分解成单色光；它是分光光度计的心脏部分。

①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨率。狭缝越小，光的单色性越好。狭缝分为入射狭缝和出射狭缝。

 ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；

 ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；

棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,  石英棱镜:紫外、可见

光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200条/mm, 根据光的衍射和干涉原理。

棱镜:玻璃350～3200 nm，石英185～4000 nm。

光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。

棱镜单器由棱镜、透镜和狭缝组成。单色的纯度决定于棱镜的色散率和出射狭缝的宽度。

玻璃棱镜对400～1000nm波长的光色散较大，适用于可见光分光光度计。

光栅是利用光的衍射和干涉原理而进行分光作用。具有色散均匀、工作波长范围宽、分辨率高等特点，一般用于中高档仪器中。

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；

⑤出射狭缝。

 

1.入射狭缝 2.准直透镜 3.棱镜 4.聚焦棱镜 5.出射狭缝

3、吸收池(比色皿)：用于盛装试液和参比溶液。玻璃:可见,  石英:紫外、可见。

规格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。

4、检测器：是把透过吸收池后的透射光强度转换成电讯号的装置。故又称为光电转换器，（光电管、光电倍增管）。

5、显示器：将放大的电信号以透光率Ｔ或吸光度Ａ的方式显示或记录下来（检流计、微安表、数字显示记录仪等）。将监测器输出的信号放大并显示出来的装置。

二、紫外-可见分光光度计的光学性能

三、紫外-可见分光光度计的仪器类型

（一）可见分光光度计  

  （二）紫外-可见分光光度计

      1.单光束分光光度计

      2.双光束分光光度计

      3.双波长分光光度计                 

 

第四节分析条件的选择

一、仪器测量条件的选择

（一）测量波长的选择

选择最大吸收波长作为入射光。

（二）读书范围的选择

读数范围应控制在吸光度为0.2~0.7、  透光率为20%~65%之间。

二、显色反应条件的选择：

（一）对显色剂及显色反应的要求

 (二)显色反应的条件

三、参比溶液的选择

（一）溶剂参比溶液  

 (二)试剂参比溶液

  （三）试样参比溶液  

（四）平行操作参比溶液

 

第五节 定性定量分析方法

一、定性分析方法

（一）对比吸收光谱的一致性

    对照品和样品同时绘制吸收曲线进行对比。

(二)对比吸收光谱特征数据

l_max ， l_min ，ε 等

（三） 对比吸光度（或吸光系数）的比值

二、杂质检查

1、组分在某波长处无吸收

杂质有吸收：如: 乙醇中含苯，在λ＝256 nm处测A值检查苯

组分有吸收，杂质无吸收：A↓，E↓。

2、杂质限量检查

如：肾上腺素中的肾上腺酮（杂质）的检查，在λ＝310nm处杂质有吸收，可测得肾上腺酮的限量（≤0.06％）。

二、定量分析方法

（一）单组分溶液的定量方法

注意使用溶剂的截止波长。

1、标准曲线法

      配制稀系列对照品溶液C₁～C₅，测定吸光度A₁～A₅，绘制标准曲线。由标准曲线计算样品浓度Cx。

2、标准溶液对比法对照法

由关系式Cx：

3、吸光系数法

已知E或e，求C（主要浓度的单位）。

(二)二元组分溶液的定量方法

1.解联立方程组法     

2.等吸收波长消去法

  3.差示分光光度法

第六节  紫外-可见吸收光谱在有机化合物结构分析中的应用简介

一、有机化合物的紫外-可见吸收光谱

有机化合物的紫外-可见吸收光谱主要是由分子中价电子的能级跃迁而产生的。电子的能级跃迁有4个基本类型。

二、根据紫外-可见吸收光谱推断官能团

（一）结构异构体的推断

    反式异构体最大吸收波长λmax和摩尔吸收系数εmax都大于顺式异构体。例：1,2-二苯乙烯的反式异构体的光谱特征为λmax＝295.5nm，εmax＝29 000L/（mol·cm）；1,2-二苯乙烯的顺式异构体的光谱特征为λmax＝280nm，εmax＝10 500L/（mol·cm）。

 

 

 

 

 

 

               （Ⅰ）                               （Ⅱ）

 

（2）顺反异构体的推断 

  反式异构体最大吸收波长λ_max和摩尔吸收系数ε_max都大于顺式异构体。例：1,2-二苯乙烯的反式异构体的光谱特征为λ_max＝295.5nm，ε_max＝29 000L/（mol·cm）；1,2-二苯乙烯的顺式异构体的光谱特征为λ_max＝280nm，ε_max＝10 500L/（mol·cm）。

 

 

 

 

 

 

反式1,2-二苯乙烯                         顺式1,2-二苯乙烯

（3）互变异构体的推断

分子中存在共轭体系时，其λ_max、ε_max一般要大于非共轭体系异构体的光谱特征。

例：乙酰乙酸乙酯有酮式和烯醇式两个互变异构体，酮式结构没有共轭双键，其光谱特征为：λ_max=204nm，ε_max=16L/(mol·cm) ；烯醇式异构体有共轭双键，其光谱特征为λ_max=245nm，ε_max=1.8×10⁴L/(mol·cm)。